基于CellCelector等技术的单细胞测序解决方案及应用

1.单细胞基因测序（Single-Cell Sequencing）

单细胞基因测序，简单来说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞基因测序（Single Cell Sequencing），认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。

传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）都需要从超过10万个细胞中提取一大堆（bulk）DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。

在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。

关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将探讨基于CellCelector的单细胞基因测序解决方案，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。

2．单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析

单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增（全基因组扩增和全转录组扩增）---测序以及后续的分析和应用。

以CTC（循环肿瘤细胞，Circulating Tumor Cell）为例，由于CTC在外周血中每10⁶-10⁷个单核细胞中才发现1个，因此单细胞的分离和测序对检测技术的灵敏度和特异度均提出了极高要求。

2.1 单细胞的富集和分离

2.1.1 单细胞的富集

单细胞通常的量比较稀少，比如CTC在外周血中每10⁶-10⁷个单核细胞中才发现1个， 因此对检测技术的灵敏度和特异度均提出了极高要求。通常第一步是细胞的富集，以便后续的的单细胞的分离和提取。现在市场上CTC富集设备主要基于免疫磁珠、大小、微流控等方法分离。

2.1.2 单细胞的分离

手动显微操作、流式细胞术（FACS）、激光捕获显微切割（LCM）、微流控芯片等常用来分离细胞，但需要大量细胞样品，不适合稀有样品的无损伤分离，比如CTC细胞。 CellCelector (Automated Lab Solutions)可以实现稀有的CTC细胞样品无损伤快速分离，分离回收的细胞还可以应用于下游的培养、二代测序等分析。

CellCelector高分辨无损伤原位细胞分析分选技术，在高分辨率视野下，利用荧光、相差方法分辨、透射光检测单细胞，采用全自动高精度机械臂控制、移动技术（位置移动精确到+/- 1μm），可自动分选、收集、转移靶单细胞。

2.2 全基因组扩增 （Whole Genome Amplification. WGA）/ 全转录组扩增 （Whole Transcriptome Amplification，WTA）：单细胞测序的难点

2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势

由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小（几个pg），用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR），多重置换扩增（MDA）；和基于多次退火和成环的扩增循环（MALBAC）。

1）基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR（简并寡核苷酸引物PCR扩增）

DOP-PCR是一种部分随机引物法， 其引物构成为3′-ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5′， 主要 利用3′端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导， 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。

2）多重置换扩增（MDA）

MDA是一种等温的链置换扩增反应， 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合， 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。

3）MALBAC（Multiple annealing and looping-based amplification cycles）基于多次退火和成环的扩增循环

通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增，该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。

Navin 在研究报告中指出（来源：Cancer genomics： one cell at a time），对于检测CNV（Copy Number Variation）的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al.， （2015）更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。

2.2.2 全转录组扩增

一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。

单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：oligo DT-Anchoring, Template switching等技术。

三、结合CellCelector的单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域

当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序（Next Generation Sequencing）可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。

3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗

首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。

实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体（并不一定是最致病的）的信号。

而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。

单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells）,通过CellCelector捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和基因变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果。

3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖

PGS（Pre-implantation Genetic Screening）是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常；PGD（Pre-implantation Genetic Diagnosis），主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因。

PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1）卵子的第一极体和第二极体；2）培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞（一般取1-2个细胞）；3）培养第5天左右的囊胚细胞。

例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。

CellCelector可精细无损伤完成胚胎干细胞单细胞、精子细胞、胚体、循环胎儿细胞等的分离，用于下游的测试分析。

   案例一，干细胞可以在高粘性培养基像甲基纤维素或基底膜中三维培养，所以胚体（EBs）可以在分化早期用来研究器官形成。CellCelector成功分离胚体细胞。

案例二，CellCelector成功分离精子细胞。 

案例三、Cellcelector成功分离循环胎儿细胞

基于胎儿细胞的非侵入性产前测试(NIPT)，因为没有母体DNA的污染，最有可能导致更好的检测染色体畸变包括subchromosomal缺陷。 所以比根据胎循环胎儿游离DNA 的NIPT有优势。

3.3 单细胞基因测序应用于免疫报多样性研究

用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。

案例一，分离单个免疫细胞，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析

案例二，大规模筛选和分离特异性杀伤艾滋病毒的某种基因型CD8+T细胞后，后续测序确认比对。

4、单细胞基因测序未来的发展之路

在目前来看，单细胞基因测序还处在起始的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何更高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。

更多资料欢迎联系  support@fulbio.com